PRINT, uma nova técnica de terapia genética, emprega retrotransposons derivados de aves para inserir genes inteiros em uma zona segura do genoma humano, oferecendo uma abordagem complementar ao CRISPR-Cas9, permitindo potencialmente o tratamento de doenças sem o risco de ruptura genética ou câncer. Crédito: SciTechDaily.com
Os retrotransposons podem inserir novos genes em um “porto seguro” no genoma, complementando a edição genética CRISPR.
A recente aprovação de um tratamento CRISPR-Cas9 para a doença falciforme sublinha a eficácia das tecnologias de edição genética na desactivação de genes para curar doenças hereditárias. No entanto, a capacidade de integrar genes inteiros no genoma humano como substitutos de genes defeituosos ou prejudiciais permanece inatingível.
Uma nova técnica que emprega um retrotransposão de aves para inserir genes no genoma é mais promissora para a terapia genética, uma vez que insere genes num “porto seguro” no genoma humano onde a inserção não irá perturbar genes essenciais ou levar ao cancro.
Retrotransposons, ou retroelementos, são pedaços de ADN que, ao ser transcrito para ARN, codifica enzimas que copiam o RNA de volta ao DNA no genoma – um ciclo egoísta que sobrecarrega o genoma com DNA retrotransposon. Cerca de 40% do genoma humano é composto por este novo ADN “egoísta”, embora a maioria dos genes esteja deficiente, o chamado ADN lixo.
A nova técnica, chamada INserção precisa de transgenes mediada por RNA, ou PRINT, aproveita a capacidade de alguns retrotransposons de inserir eficientemente genes inteiros no genoma sem afetar outras funções do genoma. O PRINT complementaria a capacidade reconhecida da tecnologia CRISPR-Cas de desativar genes, fazer mutações pontuais e inserir pequenos segmentos de DNA.
Uma descrição do PRINT, desenvolvido no laboratório de Kathleen Collins, professora de biologia molecular e celular da Universidade da Califórnia, Berkeley, foi publicada recentemente na revista Biotecnologia da Natureza.
PRINT envolve a inserção de novo DNA em uma célula usando métodos de entrega semelhantes aos usados para transportar CRISPR-Cas9 em células para edição do genoma. Para PRINT, um pedaço de RNA entregue codifica uma proteína de retroelemento comum chamada proteína R2, que possui múltiplas partes ativas, incluindo uma nickase – uma enzima que se liga e corta o DNA de fita dupla – e a transcriptase reversa, a enzima que gera a cópia do DNA de ARN. O outro RNA é o modelo para o DNA do transgene a ser inserido, além dos elementos de controle da expressão gênica – um cassete de transgene autônomo completo que a proteína R2 insere no genoma, disse Collins.
Foi demonstrado que os retrotransposons encontrados nos genomas do pardal-de-garganta-branca e do tentilhão-zebra conduzem com segurança os transgenes para o genoma humano, fornecendo uma abordagem de terapia genética complementar à edição do gene CRISPR-Cas9. Crédito: Briana Van Treeck, UC Berkeley
Uma vantagem importante do uso da proteína R2 é que ela insere o transgene em uma área do genoma que contém centenas de cópias idênticas do mesmo gene – cada uma codificando o RNA ribossômico, a máquina de RNA que traduz o RNA mensageiro (mRNA) em proteína. Com tantas cópias redundantes, quando a inserção interrompe um ou alguns genes de RNA ribossômico, a perda dos genes não será perdida.
Colocar o transgene em um porto seguro evita um grande problema encontrado ao inserir transgenes através de um humano vírus vetor, que é o método comum hoje: o gene é frequentemente inserido aleatoriamente no genoma, desativando genes funcionais ou alterando a regulação ou função dos genes, potencialmente levando ao câncer.
“Uma abordagem baseada em CRISPR-Cas9 pode fixar um nucleotídeo mutante ou inserir um pequeno pedaço de DNA – fixação de sequência. Ou você pode simplesmente eliminar uma função genética por mutagênese específica do local”, disse Collins, que ocupa a cadeira da família Walter e Ruth Schubert. “Não estamos eliminando uma função genética. Não estamos corrigindo uma mutação genética endógena. Estamos adotando uma abordagem complementar, que consiste em colocar no genoma um gene expresso de forma autônoma que produza uma proteína ativa – para adicionar de volta um gene funcional como uma forma de contornar o déficit. É suplementação de transgenes em vez de reversão de mutações. Para corrigir doenças com perda de função que surgem de uma panóplia de mutações individuais do mesmo gene, isso é ótimo.”
‘Os verdadeiros vencedores foram os pássaros’
Muitas doenças hereditárias, como a fibrose cística e a hemofilia, são causadas por diversas mutações diferentes no mesmo gene, todas as quais desativam a função do gene. Qualquer terapia de edição genética baseada em CRISPR-Cas9 teria que ser adaptada à mutação específica de uma pessoa. A suplementação genética usando PRINT poderia, em vez disso, fornecer o gene correto a cada pessoa com a doença, permitindo que o corpo de cada paciente produzisse a proteína normal, independentemente da mutação original.
Muitos laboratórios acadêmicos e startups estão investigando o uso de transposons e retrotransposons para inserir genes para terapia genética. Um retrotransposon popular em estudo por empresas de biotecnologia é o LINE-1 (Long INterspersed Element-1), que em humanos se duplicou e alguns genes caroneiros para cobrir cerca de 30% do genoma, embora menos de 100 dos retrotransposons LINE-1 do nosso genoma cópias são funcionais hoje, uma fração minúscula do genoma.
Collins, junto com o colega de pós-doutorado da UC Berkeley, Akanksha Thawani, e Eva Nogales, ilustre professora do Departamento de Biologia Molecular e Celular da UC Berkeley e investigadora do Howard Hughes Medical Institute, publicaram uma estrutura de microscopia crioeletrônica da proteína enzimática codificada pelo retroelemento LINE-1 em 14 de dezembro na revista Natureza.
Esse estudo deixou claro, disse Collins, que seria difícil projetar a proteína retrotransposon LINE-1 para inserir com segurança e eficiência um transgene no genoma humano. Mas pesquisas anteriores demonstrando que os genes inseridos na região repetitiva e codificadora do RNA ribossômico do genoma (o rDNA) são expressos normalmente sugeriram a Collins que um retroelemento diferente, chamado R2, poderia funcionar melhor para a inserção segura do transgene.
Como o R2 não é encontrado em humanos, Collins e o pesquisador sênior Xiaozhu Zhang e a pós-doutoranda Briana Van Treeck, ambos da UC Berkeley, examinaram o R2 em mais de uma vintena de genomas animais, de insetos ao caranguejo-ferradura e outros eucariotos multicelulares, para encontrar uma versão altamente direcionada para regiões de rDNA no genoma humano e eficiente na inserção de longos comprimentos de DNA na região.
“Depois de perseguir dezenas deles, os verdadeiros vencedores foram os pássaros”, disse Collins, incluindo o tentilhão-zebra e o pardal-de-garganta-branca.
Embora os mamíferos não tenham R2 em seus genomas, eles têm os locais de ligação necessários para que o R2 se insira efetivamente como um retroelemento – provavelmente um sinal, disse ela, de que os predecessores dos mamíferos tinham um retroelemento semelhante ao R2 que de alguma forma foi expulso. o genoma dos mamíferos.
Em experimentos, Zhang e Van Treeck sintetizaram a proteína R2 que codifica mRNA e um modelo de RNA que geraria um transgene com uma proteína fluorescente expressa por um promotor de RNA polimerase. Estes foram cotransfectados em células humanas cultivadas. Cerca de metade das células acenderam em verde ou vermelho devido à expressão de proteínas fluorescentes sob luz laser, demonstrando que o sistema R2 inseriu com sucesso uma proteína fluorescente funcional no genoma.
Outros estudos mostraram que o transgene de fato se inseriu nas regiões de rDNA do genoma e que cerca de 10 cópias do modelo de RNA poderiam ser inseridas sem interromper a atividade de fabricação de proteínas dos genes de rDNA.
Um centro gigante de biogênese ribossomo
A inserção de transgenes em regiões de rDNA do genoma é vantajosa por outras razões além de lhes proporcionar um porto seguro. As regiões de rDNA são encontradas nos braços grossos de cinco cromossomos separados. Todos esses braços grossos se amontoam para formar uma estrutura chamada nucléolo, na qual o DNA é transcrito em RNA ribossômico, que então se dobra na maquinaria ribossômica que produz proteínas. Dentro do nucléolo, a transcrição do rDNA é altamente regulada e os genes passam por reparos rápidos, uma vez que qualquer quebra do rDNA, se deixada para se propagar, pode interromper a produção de proteínas. Como resultado, qualquer transgene inserido na região do rDNA do genoma seria tratado com luvas de pelica dentro do nucléolo.
“O nucléolo é um centro gigante de biogênese do ribossomo”, disse Collins. “Mas também é um ambiente de reparação de ADN realmente privilegiado, com baixo risco oncogénico de inserção genética. É brilhante que esses retroelementos bem-sucedidos — estou antropomorfizando-os — tenham entrado no DNA ribossômico. É multicópia, é conservado e é um porto seguro no sentido de que você pode interromper uma dessas cópias e a célula não se importa.”
Isso torna a região um local ideal para inserir um gene para terapia genética humana.
Collins admitiu que ainda não se sabe muito sobre como o R2 funciona e que permanecem questões sobre a biologia da transcrição do rDNA: Quantos genes do rDNA podem ser interrompidos antes que a célula se importe? Como algumas células desativam muitos dos mais de 400 genes de rDNA no genoma humano, essas células são mais suscetíveis aos efeitos colaterais do PRINT? Ela e sua equipe estão investigando essas questões, mas também ajustando as várias proteínas e RNAs envolvidos na inserção de retroelementos para fazer o PRINT funcionar melhor em células cultivadas e células primárias de tecido humano.
O resultado final, porém, é que “funciona”, disse ela. “É que precisamos entender um pouco mais sobre a biologia do nosso rDNA para realmente tirar vantagem dele.”
Referência: “Aproveitando proteínas de retroelementos eucarióticos para inserção de transgenes em loci de porto seguro humanos” por Xiaozhu Zhang, Briana Van Treeck, Connor A. Horton, Jeremy JR McIntyre, Sarah M. Palm, Justin L. Shumate e Kathleen Collins, 20 de fevereiro de 2024 , Biotecnologia da Natureza.
DOI: 10.1038/s41587-024-02137-y
Outros co-autores do Biotecnologia da Natureza no artigo estão os alunos de pós-graduação da UC Berkeley, Connor Horton, Jeremy McIntyre, Sarah Palm e Justin Shumate. O trabalho contou com o apoio do Instituto Nacional de Saúde (F32 GM139306, DP1 HL156819, T32 GM07232) e a Fundação Shurl e Kay Curci. Collins solicitou patentes para o PRINT e foi cofundador de uma empresa, Addition Therapeutics, para desenvolver o PRINT como terapia genética.
