Alfa-1 Glicoproteína Ácida Alta O Que Significa?

Para que serve o exame de muco proteínas

Answered By: Sean Hall Date: created: Oct 19 2023

A determinação das mucoproteínas em amostras de sangue é útil na avaliação de processos inflamatórios. As mucoproteínas (seromucóides) são separadas das proteínas coaguláveis pelo calor por precipitação seletiva com solução de ácido perclórico.

O que quer dizer Alfa 1?

Alfa 1 – Causa, Sintomas e Tratamento A deficiência de Alfa 1-Antitripsina (ATT) é uma doença genética e hereditária, caracterizada especialmente por níveis muito baixos no sangue da proteína ATT, que é produzida pelo fígado. Com esta deficiência, os pulmões ficam desprotegidos contra inflamações, o que causa Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC).

• Em casos ainda mais graves, há um acúmulo de ATT no fígado, ocasionando danos hepáticos graves.
• A doença costuma se manifestar na idade adulta (entre a terceira e a quarta década de vida).
• Em casos menos frequentes, surge desde o nascimento e em qualquer idade como doença crônica do fígado.Causa A Alfa 1, como doença genética e hereditária, é passada dos pais para os filhos por meio dos genes.

Os sintomas mais comuns de Alfa 1 são: falta de ar, chiado no peito, tosse crônica e maior produção de catarro, gripes recorrentes, icterícia (olhos e pele amarelados), ascite (edema nas pernas e na barriga), vômitos com sangue, rápido cansaço mediante exercício, asma e alergias recorrentes, dilatação dos bronquíolos e problemas hepáticos indeterminados.

O tratamento indicado para a deficiência de Alfa 1 é a Terapia de Reposição. O método consiste na reposição da proteína Alfa 1 por aplicação venosa. A proteína é retirada do sangue de uma pessoa saudável, purificada e administrada em pacientes com deficiência de ATT. A vacinação contra hepatites e gripe, além do abandono do hábito de fumar também são medidas necessárias.

Adotar um modo saudável de vida, com alimentação balanceada e exercícios físicos também são medidas recomendáveis. Pneumologista, nefrologista, geneticista. Fonte: Livro Doenças Raras de A a Z- Instituto Vidas Raras/ Federação das Doenças Raras de Portugal (Fedra) : Alfa 1 – Causa, Sintomas e Tratamento

Qual é a importância da glicoproteína?

As glicoproteínas são carboidratos ligados a proteínas e são de extrema importância para a manutenção de processos biológicos fundamentais, como por exemplo, fertilização, regulação de processos imunes, replicação viral, infecção parasítica, crescimento celular, adesão célula-célula, degradação de coágulos de sangue e

Quem produz glicoproteína?

Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do retrovírus HTLV-1 em células de mamíferos Artigos • • O retrovírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 é o agente etiológico da leucemia das células T do adulto e da paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1.

• O genoma proviral é composto por 9.032 pares de bases, contendo genes estruturais e regulatórios.
• A glicoproteína transmembrana gp 21 é codificada pelo gene estrutural env.
• O desenvolvimento de metodologias para a expressão heteróloga de proteínas, assim como a obtenção de uma linhagem celular que expresse a gp 21 recombinante constitutivamente são os principais objetivos do trabalho.

O fragmento codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR e clonado no vetor pCR2.1-TOPO. Posteriormente, foi realizada a subclonagem no vetor de expressão pcDNA3.1+. A transfecção da linhagem celular de mamíferos HEK 293 foi realizada de maneira transitória e permanente.

1. A produção da gp 21 recombinante foi confirmada por citometria de fluxo e a linhagem celular produtora será utilizada em ensaios de imunogenicidade.
2. Glicoproteína transmembrana; HTLV-1; Clonagem; Expressão de proteínas The retrovirus HTLV-1 is the etiological agent of the adult T-cell leukemia and HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis.

The proviral genome has 9,032 base pairs, showing regulatory and structural genes. The env gene encodes for the transmembrane glycoprotein gp 21. The development of methodologies for heterologous protein expression, as well as the acquisition of a cellular line that constituently expresses the recombinant, were the main goals of this work.

The DNA fragment that encodes for gp 21 was amplified by nested-PCR and cloned into a pCR2.1-TOPO vector. After which, a sub-cloning was realized using the expressing vector pcDNA3.1+. The transfection of mammalian cells HEK 293 was performed transitorily and permanently. Production of the recombinant gp 21 was confirmed by flux cytometry experiments and the cell line producing protein will be used in immunogenicity assays.

Transmembrane glycoprotein; HTLV-1; Cloning; Protein expression

• ARTIGO ARTICLE
• Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do retrovírus HTLV-1 em células de mamíferos
• Cloning and transmembrane glycoprotein expression of the retrovirus HTLV-1 in mammals’ cells
• Flora Cristina Lobo Penteado I, II ; Luciene Medeiros I ; Maristela Delgado Orellana I ; Patricia Palma I ; Aparecida Maria Fontes I ; Osvaldo Massaiti Takayanagui III ; Dimas Tadeu Covas IV
• I Laboratório de Pesquisa do Centro Regional de Hemoterapia do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
• II Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas Júlio de Mesquita Filho da Universidade Estadual Paulista, Araraquara, SP, Brasil
• III Departamento de Neurologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
• IV Departamento de Clinica Medica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
• RESUMO

O retrovírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 é o agente etiológico da leucemia das células T do adulto e da paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1. O genoma proviral é composto por 9.032 pares de bases, contendo genes estruturais e regulatórios.

• A glicoproteína transmembrana gp 21 é codificada pelo gene estrutural env.
• O desenvolvimento de metodologias para a expressão heteróloga de proteínas, assim como a obtenção de uma linhagem celular que expresse a gp 21 recombinante constitutivamente são os principais objetivos do trabalho.
• O fragmento codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR e clonado no vetor pCR2.1-TOPO.

Posteriormente, foi realizada a subclonagem no vetor de expressão pcDNA3.1+. A transfecção da linhagem celular de mamíferos HEK 293 foi realizada de maneira transitória e permanente. A produção da gp 21 recombinante foi confirmada por citometria de fluxo e a linhagem celular produtora será utilizada em ensaios de imunogenicidade.

Palavras-chaves: Glicoproteína transmembrana. HTLV-1. Clonagem. Expressão de proteínas. ABSTRACT The retrovirus HTLV-1 is the etiological agent of the adult T-cell leukemia and HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis. The proviral genome has 9,032 base pairs, showing regulatory and structural genes.

The env gene encodes for the transmembrane glycoprotein gp 21. The development of methodologies for heterologous protein expression, as well as the acquisition of a cellular line that constituently expresses the recombinant, were the main goals of this work.

The DNA fragment that encodes for gp 21 was amplified by nested-PCR and cloned into a pCR2.1-TOPO vector. After which, a sub-cloning was realized using the expressing vector pcDNA3.1+. The transfection of mammalian cells HEK 293 was performed transitorily and permanently. Production of the recombinant gp 21 was confirmed by flux cytometry experiments and the cell line producing protein will be used in immunogenicity assays.

Key-words: Transmembrane glycoprotein. HTLV-1. Cloning. Protein expression. O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é considerado o agente causador da leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) 16 e da paraparesia espástica tropical (TSP), também conhecida como mielopatia associada ao HTLV-1 (HAM) 6,

• Sua transmissão se dá por contato sexual, por transfusão de sangue e de seus componentes celulares, entre usuários de drogas injetáveis e, principlamente, via amamentação.
• A célula alvo ao ser infectada tem suas vias de ativação e morte celular alteradas pela incorporação do material genético do vírus, passando a produzir as proteínas virais.

O genoma proviral do retrovírus HTLV-1 é composto por 9.032 pb 15 e contém genes estruturais e regulatórios. O gene estrutural env codifica as duas glicoproteínas que constituem o envelope viral. O envelope do HTLV-1 é o primeiro elemento a interagir com a célula-alvo e desempenha um papel crucial no processo de infecção pois permite a entrada do retrovírus na célula.

As glicoproteínas são sintetizadas no retículo endoplasmático inicialmente como uma poliproteína precursora: a gp 61. Posteriormente, essa poliproteína é levada ao complexo de Golgi onde é glicosilada e clivada pela ação de uma protease celular, gerando duas subunidades. A primeira é a glicoproteína de superfície (gp 46) responsável pela ligação do retrovírus ao receptor da célula alvo, e a segunda é a glicoproteína transmembrana (gp 21) responsável pela fusão do envelope viral com a membrana da célula-alvo 13,

As glicoproteínas e seus fragmentos já foram expressados em bactérias 17, em leveduras 10, em células de insetos 1 14 e em células de mamíferos 2, Além de usarem diferentes sistemas de expressão, estes trabalhos também diferem quanto a utilização dos produtos recombinantes; as glicoproteínas do envelope do HTLV-1 podem ser incorporadas às reações bioquímicas in vitro, com o objetivo de estudar a formação de sincícios e a entrada do vírus nas células alvo 4, podem ser utilizadas no diagnóstico da infecção pelo HTLV-1 11 ou podem ser utilizadas em protocolos de imunização experimental de animais, com o objetivo de produzir uma vacina recombinante contra o vírus 9,

1. O objetivo do trabalho é a expressão in vitro da gp 21 do envelope do HTLV-1 em células de mamíferos.
2. A obtenção de uma linhagem celular que expresse constitutivamente a proteína recombinante será de grande utilidade para a realização de ensaios de imunogenicidade e no diagnóstico da infecção pelo HTLV-1.

MATERIAL E MÉTODOS Isolamento, amplificação e preparação do fragmento referente a gp 21, O fragmento codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR, a partir do DNA proviral, com a utilização dos primers 5′-CCTGTTCCCACCCTAGGATCC-3′ e 5′-GAAGTTGCTGCAGGAGAAGGAG-3′ na primeira reação, e 5′-GAATTCCATGGGAGCCGGAGTGGCTGGC-3′ e 5′-GCGGCCGCTTACAGGGATGACTCAGGTTTTATAAG-3′ na seunda reação.

A seqüência de nucleotídeos utilizada para o desenho dos primers foi a do protótipo ATK-1, depositada no GenBank sob o número de acesso J02029, referente ao genoma completo do HTLV-1. O par de primers utilizado na segunda reação foi responsável pela adição das seqüências codificantes dos sítios de restrição das enzimas Eco RI na região terminal 5′ e Not I na região terminal 3′ do fragmento amplificado.

O produto da PCR foi submetido à extração com fenol clorofórmio, seguida de precipitação com acetato de sódio 2M. O DNA precipitado foi diluído com 40uL de água estéril. Clonagem e subclonagem do fragmento de interesse em vetores plasmidiais. O fragmento codificante da gp 21 foi clonado no vetor pCR2.1TOPO (Invitrogen, São Paulo, Brazil) conforme as instruções do fabricante.

Bactérias Escherichia coli da linhagem DH5a (Clontech, Heidelberg, Germany) competentes foram preparadas e transformadas com o vetor recombinante pelo método do cloreto de cálcio gelado por meio do choque térmico 12, de acordo com protocolos já descritos 8, A cultura foi submetida à minipreparação de plasmídeo, realizada com a utilização do kit QIAprep Spin Miniprep Kit (50) (Qiagem, Hilden, Germany), segundo as instruções do fabricante.

O fragmento codificante da gp 21 contido no vetor recombinante foi digerido usando as enzimas de restrição EcoR I e Not I na mesma reação, que foi processada a 37ºC durante 3 horas. O fragmento liberado foi purificado do gel de agarose com a utilização do QUIAEX II Gel extraction kit (Qiagem, Hilden, Germany), conforme as instruções do fabricante e, posteriormente, foi clonado no vetor de expressão em células de mamíferos pcDNA3.1+ (Invitrogen, São Paulo, Brazil).

O vetor de expressão foi primeiramente linearizado com as enzimas de restrição EcoR I e Not I. Após a purificação por meio da extração com fenol-clorofórmio, a desfosforilação foi realizada com a utilização da enzima fostatase alcalina proveniente de camarão, Shrimp Alkaline Phosphatase ( SAP ) (USB Corporation, Cleaveland, USA).

A reação foi conduzida a 37ºC durante 1 hora. A enzima foi desativada por incubação a 65ºC, durante 15 minutos. A ligação do vetor com o fragmento previamente preparado foi realizada com a utilização de da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen, São Paulo, Brazil), conforme as instruções do fabricante.

• Bactérias Escherichia coli da linhagem DH5a competentes foram preparadas e transformadas com o vetor recombinante, conforme descrito neste mesmo item.
• Seqüenciamento do fragmento inserido no vetor recombinante.
• Para o seqüenciamento foi utilizado o ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Foster City, USA).

O protocolo da reação foi conduzido conforme as especificações do fabricante. Foram feitas duas reações: a primeira com o primer universal T7 sense e a segunda com o primer universal BGH anti- sense, Os produtos das reações foram submetidos à precipitação com acetato de potássio 3M e etanol absoluto.

• A eletroforese foi conduzida no aparelho ABI Prism 377 DNA Sequencer (Applied Biossytems, Foster City, USA), usando gel de poliacrilamida a 4%, com 6M de uréia, a 1.500V, temperatura de 51ºC, durante 6 horas.
• Os eletroferogramas obtidos foram analisados por meio do software ABI Analysis Data Collection e posteriormente convertidos em seqüências de nucleotídeos por meio do software DNA Sequencing Analysis Software Versão 3.3.

A montagem das seqüências consenso foi realizada pelo software Sequencher versão 4.05 (Gene Codes Corp, Ann Arbor, USA). Transfecção de células de mamíferos com o vetor recombinante. As células da linhagem HEK 293 7 foram utilizadas para a expressão da gp 21 e encontram-se depositadas no American Type Culture Collection (ATCC) sob o número de acesso CRL-1573.

1. A transfecção transitória foi realizada por meio da técnica de lipofecção (tranfecção por lipossomos) 5 com a utilização do LipofectAMINE Reagent (Invitrogen, São Paulo, Brazil), conforme as instruções do fabricante.
2. Passadas 48 horas, as culturas foram coletadas pela adição da solução de tripsina (0,25% (v/v) tripsina, 1mM EDTA.4Na) e lavadas duas vezes com tampão PBS.

A transfecção permanente foi realizada por meio da técnica de eletroporação 3, Às cubetas foram adicionados 2,0×10 7 células e 15ug de DNA. A eletroporação foi processada a 1,2 Kv, 200 ohms e 10uF. Após 10 dias de tratamento da cultura com 800ug/mL do antibiótico geneticina G418, observou-se o aparecimento de clones isolados que foram coletados para a expansão.

• Culturas semiconfluentes foram coletadas e utilizadas para a análise.
• Análise da expressão do RNAm codificante da glicoproteína transmembrana.
• A extração do RNA total das células transfectadas foi feita com utilização do RNAsy Mini Kit (Qiagem, Hilden, Germany) de acordo com as instruções do fabricante.

O RNA extraído foi utilizado na PCR como template para controle da contaminação com DNA genômico. Os primers 5′-GAATTCCATGGGAGCCGGAGTGGCTGGC-3′ e 5′-GCGGCCGCTTACAGGGATGACTCAGGTTTTATAAG-3′ foram utilizados. A análise da expressão do RNAm foi realizada por RT-PCR.

1. O cDNA foi produzido com o primer anti- sense 5′-GCGGCCGCTTACAGGGATGACTCAGGTTTTATAAG-3′ por meio da utilização do kit Superscript II (Invitrogen, São Paulo, Brazil), conforme as instruções do fabricante.
2. A PCR foi conduzida conforme já descrito neste item.
3. Análise da expressão da glicoproteína transmembrana recombinante.

As células tranfectadas foram analisadas quanto a produção da gp 21 recombinante pela técnica de citometria de fluxo. Foram utilizadas 1×10 6 células de cada amostra para o experimento. O sedimento celular foi ressuspendido com uma solução fixadora e permeabilizadora (paraformaldeído 2% (m/v), EGTA 50mM, e Triton X-100 0,3% (v/v) em tampão PBS), que agiu a 37ºC durante 10 minutos.

Após a lavagem com tampão PBS, as células foram submetidas à incubação com a solução de bloqueio (albumina de soro bovino 2% (m/v), soro de cabra 5% (v/v) em tampão PBS) a 37ºC durante 1 hora. A marcação com o anticorpo primário monoclonal anti gp 21 de HTLV-1, produzido em camundongo (NEN Life Science Products, Boston, USA) (diluído 1:100 em solução de bloqueio), foi realizada também a 37ºC durante 1 hora.

Posteriormente, as células foram lavadas com tampão PBS e o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado com FITC (GAM – Goat antimouse IgG FITC) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) foi adicionado, agindo por 15 minutos a temperatura ambiente sob o abrigo da luz.

1. Após duas etapas de lavagem com tampão PBS as células foram analisadas pelo software Cell Quest no aparelho FAC Sort (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA).
2. Como controle positivo foram utilizadas células da linhagem MT-2, que possuem o genoma do HTLV-1 inserido em seu material genético.
3. Para o controle negativo da produção da proteína recombinante foram utilizadas células HEK 293 não transfectadas.

RESULTADOS O fragmento gênico correspondente à região codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR, inserido no vetor de clonagem pCR2.1TOPO e subclonado no vetor de expressão pcDNA3.1+, com a utilização das enzimas de restrição Eco RI e Not I.

A presença do fragmento codificante da gp 21 no vetor de recombinante foi confirmada por meio do seqüenciamento de nucleotídeos. A mostra o eletroferograma que representa parte da seqüência obtida quando utilizado o primer T7 sense, indicando a localização do códon iniciador da tradução. O vetor recombinante, depois de confirmado, foi inserido em células de mamíferos da linhagem HEK 293.

A transfecção transitória foi realizada e após 48 horas de cultivo com meio de cultura apropriado, as células foram coletadas para as análises. Clones isolados foram observados na transfecção permanente após 10 dias de tratamento das células com o antibiótico.

Depois de isolados e expandidos, os clones foram novamente coletados para as análises. O RT-PCR foi realizado e um fragmento de 506pb foi amplificado (tamanho aproximado da gp 21 contendo as seqüências codificantes dos sítios de restrição para as enzimas Eco RI e Not I) indicando a presença do RNAm codificante da gp 21, como mostra a,

A expressão transitória do RNAm codificante da gp 21 não foi observada. As células tranfectadas foram analisadas também quanto a produção da proteína recombinante, por meio da técnica de citometria de fluxo. Primeiramente, foram analisadas células da linhagem MT-2 (que possuem o genoma do HTLV-1 inserido em seu material genético) para o controle positivo da produção da gp 21.

Células da linhagem HEK 293 não transfectadas foram utilizadas como controle negativo. Os resultados obtidos com as amostras da transfecção permanente e transitória, respectivamente, se encontram representados no gráfico da ; 64% das células da cultura mista e 48% das células do clone isolado apresentaram fluorescência, indicando a expressão da proteína recombinante.

DISCUSSÃO A glicoproteína transmembrana é considerada uma das proteínas mais imunogênicas do HTLV-1. A obtenção de uma linhagem celular que expresse a proteína recombinante constitutivamente possibilita o estudo mais aprofundado dos mecanismos que envolvem a gp 21 com a infectividade do vírus, por meio da utilização da linhagem celular transfectada em ensaios laboratoriais de imunogenicidade e de diagnóstico.

• O fragmento codificante da gp 21 foi clonado em vetores plasmidiais e confirmado pelo seqüenciamento de nucleotídeos.
• A expressão da gp 21 recombinante foi possibilitada pela utilização do vetor de expressão pcDNA3.1+ sob o controle do promotor de citomegalovírus.
• Duas técnicas foram utilizadas para a transfecção da linhagem celular de mamífero HEK 293: lipofecção e eletroporação.

A lipofecção foi a mais reprodutível, rápida e de baixo custo. A transfecção foi realizada de maneira transitória e permanente. Na expressão transitória não foi observada a presença do RNAm codificante da gp 21, provavelmente pela pouca quantidade de células utilizadas na extração do RNA total, e por se tratar de uma cultura mista onde parte das células não têm o vetor recombinante.

A proteína recombinante foi detectada em 64% das células analisadas. Na transfecção permanente três clones foram analisados quanto à produção do RNAm codificante da gp 21; todos são positivos. A proteína recombinante também está sendo expressada em 48% das células do clone analisado. Como a técnica utilizada para essa análise não é quantitativa, não é possível afirmar que a expressão foi maior nas células da transfecção transitória do que na transfecção permanente.

Também, porque o resultado se refere a amostragem utilizada e não ao total de células. Uma linhagem celular que expresse a proteína recombinante de maneira definitiva será estudada.

1. Por fim, pode-se concluir que tanto a cultura mista (expressão transitória) quanto o clone (expressão permanente) analisados demonstraram uma significativa porcentagem de células expressando a gp 21 do HTLV-1 recombinante.
2. Recebido para publicação em 5/2/2004
3. Aceito em 25/1/2006

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• Dra Flora Cristina Lobo Penteado Centro Regional de Hemoterapia do HCFMRP/Hemocentro de Ribeirão Preto R. Tenente Catão Roxo 2501 14051-140 Ribeirão Preto, SP, Brasil Tel: 55 16 2101-9300, Fax: 55 16 2101-9309

• Publicação nesta coleção 05 Maio 2006
• Data do Fascículo Abr 2006

• Aceito 25 Jan 2006
• Recebido 05 Fev 2004

: Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do retrovírus HTLV-1 em células de mamíferos

Qual o significado de glicoproteína?

Origem: Wikipédia, a enciclopédia livre. A glicosilação de proteínas N-ligadas (N-glicosilação de N-glicanos) nos resíduos Asn (motivos Asn-X-Ser/Thr) em glicoproteínas. As glicoproteínas são proteínas que contêm cadeias de oligossacarídeos (glicanos) covalentemente ligados a cadeias laterais de polipeptídeos,

O hidrato de carbono é ligado à proteína numa modificação translacional ou pós-traducional, Este processo é conhecido como a glicosilação, Proteínas extracelulares segregadas são geralmente glicosiladas. Em proteínas que possuem segmentos que se estendem no meio extracelular, os segmentos extracelulares também são glicosiladas.

As glicoproteínas são muitas vezes proteínas integrais de membrana importantes, em que desempenham um papel nas interações célula-célula. As glicoproteínas são também formadas no citosol, mas as suas funções e os caminhos que produzem estas modificações neste compartimento são menos compreendidas.

• As glicoproteínas são facilmente marcadas com o corante PAS ( ácido periódico-Schiff ), que é utilizado na histologia para identificar células com alto conteúdo glicoproteico.
• As células assim marcadas são ditas PAS+.
• É um exemplo de célula rica em glicoproteína a célula caliciforme, amplamente distribuída por diversas mucosas do organismo.

Segundo o Baynes, Jonh W. as glicoproteínas são oligossacarídeos ramificados ligados covalentemente a Asp. ou Sr/Thr, e pode ter uma única cadeia de oligossacarídeo N-ligada ou pode ter vários desse tipo de oligossacarídeo. (pag.353, 3a Edição, Bioquímica Medica)

Onde encontrar glicoproteína?

Graduação em Ciências Biológicas (Unicamp, 2012) Mestrado Profissional em Conservação da Fauna Silvestre (UFSCar e Fundação Parque Zoológico de São Paulo, 2015). Este artigo foi útil? Considere fazer uma contribuição: Ouça este artigo: Polissacarídeos e oligossacarídeos são classes de carboidratos que podem ter função estrutural, como a quitina e a celulose, função de armazenar energia, como o glicogênio e o amido e ainda podem ser sinalizadores e transportadores de informações.

1. Por exemplo, alguns possuem o papel de sinalizar a proteínas a localização em organelas específicas, ou mesmo levá-la à degradação, quando necessário.
2. Na maior parte das vezes, este carboidrato que leva a informação está ligado covalentemente a uma proteína ou lipídio,
3. É o que chamamos de glicogonjugado.

Os glicoconjugados são moléculas biologicamente ativas de proteínas com glicosaminoglicanos (proteoglicanos), com esfingolipídeos (glicolipídeos) e com oligossacarídeos ligados a uma proteína ( glicoproteínas ). As glicoproteínas são proteínas que possuem ligações covalentes a uma ou mais cadeias de oligossacarídeos (polissacarídeos pequenos).

Essas cadeias são bem heterogêneas, influenciando no dobramento e na estabilidade da proteína e acabam gerando informações sobre o destino dela. Será um local de alto reconhecimento e afinidade por outras proteínas. As glicopreoteínas normalmente são encontradas na superfície externa da membrana plasmática, no sangue, na matriz celular e a são a maioria das proteínas secretadas.

Podemos encontrá-las também dentro das células, em grânulos de secreção, nos lisossomos ou no complexo de Golgi, Em um processo pós-tradução, a proteína pode sofrer algumas modificações, uma delas é chamada de glicosilação. Ocorre com alguns tipos de proteínas, por exemplo, algumas extracelulares ou que possuem segmentos extracelulares.

Mudanças nas propriedades físico-químicas como o aumento da solubilidade proteica, através da adição de açúcares com a estrutura hidrofílica. Pode alterar viscosidade, conformação, locais de ligação e desnaturação. Quando em uma região da proteína se agrupam cadeias de carboidratos carregadas negativamente, leva a uma estrutura em bastão, pela repulsão de cargas. Quando uma proteína sai do retículo endoplasmático e é encaminhada ao complexo de Golgi e lá sofre modificações, essas cadeias de oligossacarídeos auxiliarão como marcadores do destino das proteínas na célula. Muitas vezes existem as ações biológicas; São mediadoras entre a célula e a matriz celular; Agem nas secreções, nas migrações intracelulares e na inserção das membranas. Protegem contra a proteólise, mas também marcam as mal dobradas para a degradação.

Exemplos de glicoproteínas:

Muitos hormônios como o folículo-estimulante, gonadotrofina coriônica e luteinizante presentes nas mulheres; imunoglobulina e as diversas secreções presentes nos tecidos mucosos. As glicoproteínas sulfatadas como componentes das membranas basais: laminina e estatina (esta última se liga a primeira na composição). Envolvidas na adesão celular como a tenascina, encontrada particularmente no tecido embrionário.

Existe uma técnica de estudo para marcar glicoproteínas na identificação de células com alto teor glicoproteico, é a utilização do corante PAS (ácido periódico-Schiff). As células que são marcadas pelo corante PAS são chamadas de PAS+. É o caso das células caliciformes, presentes em grande quantidade nos tecidos mucosos, por exemplo, na boca.

Asked By: Devin Young Date: created: Nov 22 2023

Qual é o valor normal da proteína C reativa

Answered By: Raymond Kelly Date: created: Nov 25 2023

Como interpretar o resultado dos exames de Proteína C-Reativa (PCR)? – Como comentado, não é possível diagnosticar um paciente apenas com a dosagem da PCR. Assim sendo, antes de tudo, o(a) médico(a) deve correlacionar o valor encontrado com a história clínica do paciente, raciocinando com cautela.

• < 0,3 mg/dL : Normal;
• 0,3 a 1 mg/dL : Pode ser normal, ou uma pequena elevação.
  • É comum que valores nesse intervalo estejam relacionados com gestação, tabagismo, sedentarismo, ou até mesmo obesidade,
• 1 a 10 mg/dL : Elevação moderada.Condições que costumam apresentar esses valores são doenças auto-imunes, como lúpus, além de bronquite, pancreatite e artrite reumatoide,
• > 10 mg/dL : Elevação considerável.Indicam infecções virais ou bacterianas agudas, vasculites ou um trauma.
• > 50 mg/dL: Elevação severa.Infecção bacteriana aguda.

Além disso, a PCR ainda pode oferecer informações acerca do risco cardiovascular, como descrito abaixo:

Asked By: Alexander Robinson Date: created: Dec 30 2022

Qual o valor do exame mucoproteína

Answered By: Curtis Davis Date: created: Dec 30 2022

Consulta esse exame sai pelo valor de R$18.

Asked By: Colin Nelson Date: created: Feb 01 2023

O que é mucoproteína no exame de sangue

Answered By: Justin Wright Date: created: Feb 04 2023

MUCOP – MUCOPROTEÍNA CBHPM: 40302660 CID10: M05, M32 Cobertura Produção do exame MEIO(S) DE COLETA Tubo seco (vermelho) ou Gel separador (amarelo) REALIZAÇÃO Segunda a sábado MÉTODO TURBIDIMETRIA E CÁLCULO Instruções de preparo Jejum: Jejum aconselhável de 4 horas. Instruções de coleta Tubo seco: Realizar coleta utilizando tubo seco.

• Após retração completa do coágulo, centrifugar a amostra, separar o soro e acondicionar corretamente conforme estabelecido para o exame.
• Tubo com gel separador : Homogeneizar imediatamente após a coleta e manter o tubo em repouso verticalmente para a completa retração do coágulo em temperatura ambiente, para evitar hemólise.

Após este período, centrifugar a amostra a a 3000 rpm por 10 minutos, para obtenção do soro (sobrenadante) e acondicionar corretamente conforme estabelecido para o exame Instruções de distribuição Transportar refrigerado (2°C a 8°C). Instruções de estabilidade A amostra é estável por até 7 dias refrigerada entre 2°C e 8°C Instruções de rejeição Amostras recebidas diferente das condições solicitadas em guia.

Instruções adicionais Data de revisão: 06/08/2020. Instruções de preparo Jejum: Jejum aconselhável de 4 horas. Instruções de coleta Tubo seco: Realizar coleta utilizando tubo seco. Após retração completa do coágulo, centrifugar a amostra, separar o soro e acondicionar corretamente conforme estabelecido para o exame.

Tubo com gel separador : Homogeneizar imediatamente após a coleta e manter o tubo em repouso verticalmente para a completa retração do coágulo em temperatura ambiente, para evitar hemólise. Após este período, centrifugar a amostra a a 3000 rpm por 10 minutos, para obtenção do soro (sobrenadante) e acondicionar corretamente conforme estabelecido para o exame Instruções de distribuição Transportar refrigerado (2°C a 8°C).

• Instruções de estabilidade A amostra é estável por até 7 dias refrigerada entre 2°C e 8°C Instruções de rejeição Amostras recebidas diferente das condições solicitadas em guia.
• Instruções adicionais Data de revisão: 06/08/2020.
• INTERPRETAÇÃO Mucoproteínas são consideradas proteínas de fase aguda, encontrando-se valores elevados em episódios de inflamação.

Valores aumentados estão presentes na febre reumática, artrite reumatoide, lúpus eritematoso disseminado, dermatomiosite, neoplasias malignas, infarto do miocárdio, esclerodermia. Valores diminuídos ocorrem na desnutrição, enfermidade hepática grave e nas gastroenteropatias perdedoras de proteínas.

Qual exame para saber se tem proteína na urina?

Eletroforese de Proteínas urinárias – Teste utilizado para se determinar os diferentes tipos e concentrações relativos de cada proteína presentes na urina.

Qual exame que detecta proteína na urina?

Por que fazer o exame de urina 24 horas? – O exame de urina 24 horas é capaz de fazer uma análise detalhada do funcionamento dos rins. Com o teste, é possível definir a taxa de filtração do sangue pelos rins, chamada de taxa de filtração glomerular. Diferentemente do exame de urina convencional, o EAS (urina tipo I), colher urina durante 24 horas determina, com exatidão, a presença e a quantidade de proteínas.

• Outras substâncias, como sódio, potássio, cálcio, fósforo, amônia, ureia, ácido úrico, magnésio e fosfato, também podem ser indicados.
• O estudo baseado no exame de urina 24 horas ajuda o médico a identificar problemas, como insuficiência renal, e apontar as causas dos cálculos renais.
• Durante a gravidez, o teste aponta o diagnóstico de pré-eclâmpsia, quando confirmada a presença de proteínas na urina.

Entenda o que o resultado de cada uma das taxas significa:

Taxa de filtração glomerular

O clearance de creatinina é a medida de quantos mililitros de sangue os rins filtram por minuto. Considerar este número é fundamental para avaliar o funcionamento dos rins. Valores de referência: Clearance de creatinina: entre 80 e 120ml/min.

Presença de proteína

A proteinúria (presença de proteínas na urina) só ocorre quando os rins estão doentes. A realização do exame de urina 24 horas permite tanto apontar a presença das proteínas totais quanto dosar a albumina na urina (albuminúria). Valores de referência: Proteinúria: menor que 150mg em 24 horas. Albuminúria: menor que 30mg em 24 horas.

Formação de cálculos renais

As presenças e a quantidade de cálcio, ácido úrico, citrato e oxalato na urina são investigados no caso da formação de cálculos renais. O excesso dessas substâncias explica o desenvolvimento de pedras nos rins. Valores de referência: Cálcio urinário: 100,0 a 300,0 mg/24h, sem dieta, e de 60 a 180 mg/24h, com dieta.

Sódio

A análise da quantidade de sódio que é eliminada na urina é importante em casos de pacientes com cirrose, hipertensão e em casos de edema. Valores de referência: Sódio urinário: 40 a 220mEq/24h. Nos pacientes que fazem restrição de sódio na dieta, o ideal é manter o sódio urinário abaixo de 100mEq/24h.

Potássio

A presença de potássio determina alguns tipos de doenças dos tubos renais. Valores de referência: Potássio urinário: 25,0 a 125,0mEq/24h.

Para que serve o exame de dosagem de ácido úrico?

Quando fazer exame de ácido úrico? – O exame de ácido úrico serve para medir os níveis de AU circulante. Sendo assim, costuma ser solicitado quando o paciente apresenta sinais de hiperuricemia, Para que o ácido úrico fique totalmente diluído, seus níveis devem ficar abaixo de 6,8 mg/dl,

Asked By: Aidan Jackson Date: created: Feb 03 2023

Onde atua o receptor alfa 1

Answered By: Carl Carter Date: created: Feb 05 2023

Os receptores α-1 são pós-sinápticos, estão no músculo liso vascular e promovem vasoconstrição e efeitos simpatomiméticos.

Asked By: Bryan Edwards Date: created: Jul 08 2023

Onde tem alfa 1

Answered By: Douglas Richardson Date: created: Jul 10 2023

O que é a deficiência de alfa-1 antitripsina? – É a redução na produção de alfa-1 antitripsina (alfa-1-AT). Às vezes, a produção é normal, mas a enzima é prejudicada e não funciona adequadamente. Em ambas as situações, a perda da função desta enzima pode causar doenças decorrentes da atividade poteasa excessiva.

Em condições normais, os tecidos do sangue e corpo é uma potente enzima conhecida como proteases (facilitar a ruptura das proteínas), que desempenha papéis importantes na defesa contra infecções e processos inflamatórios. Estas proteases devem ser cuidadosamente reguladas, pois um excesso de atividade pode causar a destruição de proteínas causando danos a diversos órgãos.

Para controle, sangue e outros tecidos têm enzimas com atividade inibitória de protease, que impedem a ação excessiva do mesmo e seus efeitos potencialmente prejudiciais. O inibidor de protease principal no sangue é a alfa-1 antitripsina e sua principal função é proteger os tecidos da atividade excessiva de proteases.

Onde fica o receptor alfa 1?

Subclasse de receptores adrenérgicos alfa que medeiam a contração do MÚSCULO LISO em uma variedade de tecidos como ARTERÍOLAS, VEIAS e ÚTERO. São geralmente encontrados em membranas pós-sinápticas e sinalizam por meio das PROTEÍNAS G GQ-G11.

O que são glicoproteínas e quais suas funções?

Glicoproteínas são proteínas que apresentam um ou mais resíduos glicídicos covalentemente ligados a sua estrutura peptídica (Bochkov, 1993). A glicosilação proteíca é um processo importante uma vez que a porção glicídica altera as propriedades, modificando a estabilidade, solubilidade e volume físico das proteínas.

Qual a diferença entre proteína e Glicoproteina?

As proteínas são classificadas segundo a forma e a função, agindo em sistemas e órgãos do corpo humano, sendo: Cromoproteínas → proteínas que conferem características pigmentares. Glicoproteínas → proteínas associadas a grupamentos glicídicos, comum no glicocalix.

• Lipoproteínas → proteínas associadas a grupamentos lipídicos.
• Nucleoproteínas → proteínas com funções voltadas especificamente para as atividades que ocorrem no núcleo.
• Endocrinoproteínas → proteínas com atividade hormonal, por exemplo, a insulina, que participa na redução do nível de açúcar no sangue.

Não pare agora. Tem mais depois da publicidade 😉 Globina → proteína que compõe a molécula de hemoglobina. Albumina → proteína importante na nutrição do embrião. Fibrinogênio → proteína componente do plasma sanguíneo, participando do processo de coagulação.

Quais as principais funções e localizações das glicoproteínas?

A glicoproteína -P é uma das proteínas mais importantes do nosso organismo, está presente nos tecidos epiteliais normais e possui a capacidade de interagir com inúmeros fármacos de diferentes classes de uso clínico, dos quais se podem referir os anti- neoplásicos, os anti-histamínicos, agentes imunossupressores,

Qual o significado de glicoproteína?

Origem: Wikipédia, a enciclopédia livre. A glicosilação de proteínas N-ligadas (N-glicosilação de N-glicanos) nos resíduos Asn (motivos Asn-X-Ser/Thr) em glicoproteínas. As glicoproteínas são proteínas que contêm cadeias de oligossacarídeos (glicanos) covalentemente ligados a cadeias laterais de polipeptídeos,

O hidrato de carbono é ligado à proteína numa modificação translacional ou pós-traducional, Este processo é conhecido como a glicosilação, Proteínas extracelulares segregadas são geralmente glicosiladas. Em proteínas que possuem segmentos que se estendem no meio extracelular, os segmentos extracelulares também são glicosiladas.

As glicoproteínas são muitas vezes proteínas integrais de membrana importantes, em que desempenham um papel nas interações célula-célula. As glicoproteínas são também formadas no citosol, mas as suas funções e os caminhos que produzem estas modificações neste compartimento são menos compreendidas.

• As glicoproteínas são facilmente marcadas com o corante PAS ( ácido periódico-Schiff ), que é utilizado na histologia para identificar células com alto conteúdo glicoproteico.
• As células assim marcadas são ditas PAS+.
• É um exemplo de célula rica em glicoproteína a célula caliciforme, amplamente distribuída por diversas mucosas do organismo.

Segundo o Baynes, Jonh W. as glicoproteínas são oligossacarídeos ramificados ligados covalentemente a Asp. ou Sr/Thr, e pode ter uma única cadeia de oligossacarídeo N-ligada ou pode ter vários desse tipo de oligossacarídeo. (pag.353, 3a Edição, Bioquímica Medica)

Para que serve o exame anti Beta 2 glicoproteína 1?

B2GLA – ANTICORPOS IGA ANTI BETA2 GLICOPROTEÍNA 1 SINÔNIMOS: B2GP1, ANTI-B2GP1 IGA, ANTI-ß2-GPI, BETA 2, ANTI BETA-2-GLICOPROTEÍNA 1, BETA2-GP CBHPM: 40308898 CID10: M32 Cobertura Produção do exame MEIO(S) DE COLETA Tubo seco (vermelho) ou Gel separador (amarelo) Instruções de coleta Tubo seco: Realizar coleta utilizando tubo seco. Após retração completa do coágulo, centrifugar a amostra, separar o soro e acondicionar corretamente conforme estabelecido para o exame.

Tubo com gel separador: Homogeneizar imediatamente após a coleta e manter o tubo em repouso verticalmente para a completa retração do coágulo em temperatura ambiente, para evitar hemólise. Após este período, centrifugar a amostra para obtenção do soro (sobrenadante) e acondicionar corretamente conforme estabelecido para o exame.

Instruções de distribuição Transportar refrigerado (2°C a 8°C). Instruções de estabilidade A amostra é estável por até 48 horas refrigerada de 2 a 8°C, após esse período manter congelada. Instruções de rejeição Amostras recebidas diferente das condições solicitadas em guia e amostras que sofreram tratamento térmico.

• Instruções adicionais Data de revisão: 26/01/2023.
• Instruções de coleta Tubo seco: Realizar coleta utilizando tubo seco.
• Após retração completa do coágulo, centrifugar a amostra, separar o soro e acondicionar corretamente conforme estabelecido para o exame.
• Tubo com gel separador: Homogeneizar imediatamente após a coleta e manter o tubo em repouso verticalmente para a completa retração do coágulo em temperatura ambiente, para evitar hemólise.

Após este período, centrifugar a amostra para obtenção do soro (sobrenadante) e acondicionar corretamente conforme estabelecido para o exame. Instruções de distribuição Transportar refrigerado (2°C a 8°C). Instruções de estabilidade A amostra é estável por até 48 horas refrigerada de 2 a 8°C, após esse período manter congelada.

• Instruções de rejeição Amostras recebidas diferente das condições solicitadas em guia e amostras que sofreram tratamento térmico.
• Instruções adicionais Data de revisão: 26/01/2023.
• INTERPRETAÇÃO Os anticorpos anticardiolipina, têm sido fortemente associados a tromboses venosas e arteriais.Estas descobertas foram primeiro observadas durante estudos sobre o Lúpus Eritematoso Sistémico, uma doença em que um dos muitos sintomas é a trombose.

O teste de autoanticorpos ?2 Glicoproteína é um ensaio útil e mais específico para ser utilizado em conjunto com os testes de anticorpos anticardiolipina e de anticoagulante lúpico tradicionalmente utilizados para ajudar no diagnóstico de trombose nos doentes de risco.

Asked By: Adam Walker Date: created: Oct 24 2023

Quem produz glicoproteína

Answered By: Aaron Martin Date: created: Oct 26 2023

Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do retrovírus HTLV-1 em células de mamíferos Artigos • • O retrovírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 é o agente etiológico da leucemia das células T do adulto e da paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1.

• O genoma proviral é composto por 9.032 pares de bases, contendo genes estruturais e regulatórios.
• A glicoproteína transmembrana gp 21 é codificada pelo gene estrutural env.
• O desenvolvimento de metodologias para a expressão heteróloga de proteínas, assim como a obtenção de uma linhagem celular que expresse a gp 21 recombinante constitutivamente são os principais objetivos do trabalho.

O fragmento codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR e clonado no vetor pCR2.1-TOPO. Posteriormente, foi realizada a subclonagem no vetor de expressão pcDNA3.1+. A transfecção da linhagem celular de mamíferos HEK 293 foi realizada de maneira transitória e permanente.

• A produção da gp 21 recombinante foi confirmada por citometria de fluxo e a linhagem celular produtora será utilizada em ensaios de imunogenicidade.
• Glicoproteína transmembrana; HTLV-1; Clonagem; Expressão de proteínas The retrovirus HTLV-1 is the etiological agent of the adult T-cell leukemia and HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis.

The proviral genome has 9,032 base pairs, showing regulatory and structural genes. The env gene encodes for the transmembrane glycoprotein gp 21. The development of methodologies for heterologous protein expression, as well as the acquisition of a cellular line that constituently expresses the recombinant, were the main goals of this work.

1. The DNA fragment that encodes for gp 21 was amplified by nested-PCR and cloned into a pCR2.1-TOPO vector.
2. After which, a sub-cloning was realized using the expressing vector pcDNA3.1+.
3. The transfection of mammalian cells HEK 293 was performed transitorily and permanently.
4. Production of the recombinant gp 21 was confirmed by flux cytometry experiments and the cell line producing protein will be used in immunogenicity assays.

Transmembrane glycoprotein; HTLV-1; Cloning; Protein expression

• ARTIGO ARTICLE
• Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do retrovírus HTLV-1 em células de mamíferos
• Cloning and transmembrane glycoprotein expression of the retrovirus HTLV-1 in mammals’ cells
• Flora Cristina Lobo Penteado I, II ; Luciene Medeiros I ; Maristela Delgado Orellana I ; Patricia Palma I ; Aparecida Maria Fontes I ; Osvaldo Massaiti Takayanagui III ; Dimas Tadeu Covas IV
• I Laboratório de Pesquisa do Centro Regional de Hemoterapia do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
• II Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas Júlio de Mesquita Filho da Universidade Estadual Paulista, Araraquara, SP, Brasil
• III Departamento de Neurologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
• IV Departamento de Clinica Medica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
• RESUMO

O retrovírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 é o agente etiológico da leucemia das células T do adulto e da paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1. O genoma proviral é composto por 9.032 pares de bases, contendo genes estruturais e regulatórios.

• A glicoproteína transmembrana gp 21 é codificada pelo gene estrutural env.
• O desenvolvimento de metodologias para a expressão heteróloga de proteínas, assim como a obtenção de uma linhagem celular que expresse a gp 21 recombinante constitutivamente são os principais objetivos do trabalho.
• O fragmento codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR e clonado no vetor pCR2.1-TOPO.

Posteriormente, foi realizada a subclonagem no vetor de expressão pcDNA3.1+. A transfecção da linhagem celular de mamíferos HEK 293 foi realizada de maneira transitória e permanente. A produção da gp 21 recombinante foi confirmada por citometria de fluxo e a linhagem celular produtora será utilizada em ensaios de imunogenicidade.

1. Palavras-chaves: Glicoproteína transmembrana. HTLV-1. Clonagem.
2. Expressão de proteínas.
3. ABSTRACT The retrovirus HTLV-1 is the etiological agent of the adult T-cell leukemia and HTLV-1 associated myelopathy/tropical spastic paraparesis.
4. The proviral genome has 9,032 base pairs, showing regulatory and structural genes.

The env gene encodes for the transmembrane glycoprotein gp 21. The development of methodologies for heterologous protein expression, as well as the acquisition of a cellular line that constituently expresses the recombinant, were the main goals of this work.

The DNA fragment that encodes for gp 21 was amplified by nested-PCR and cloned into a pCR2.1-TOPO vector. After which, a sub-cloning was realized using the expressing vector pcDNA3.1+. The transfection of mammalian cells HEK 293 was performed transitorily and permanently. Production of the recombinant gp 21 was confirmed by flux cytometry experiments and the cell line producing protein will be used in immunogenicity assays.

Key-words: Transmembrane glycoprotein. HTLV-1. Cloning. Protein expression. O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é considerado o agente causador da leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) 16 e da paraparesia espástica tropical (TSP), também conhecida como mielopatia associada ao HTLV-1 (HAM) 6,

Sua transmissão se dá por contato sexual, por transfusão de sangue e de seus componentes celulares, entre usuários de drogas injetáveis e, principlamente, via amamentação. A célula alvo ao ser infectada tem suas vias de ativação e morte celular alteradas pela incorporação do material genético do vírus, passando a produzir as proteínas virais.

O genoma proviral do retrovírus HTLV-1 é composto por 9.032 pb 15 e contém genes estruturais e regulatórios. O gene estrutural env codifica as duas glicoproteínas que constituem o envelope viral. O envelope do HTLV-1 é o primeiro elemento a interagir com a célula-alvo e desempenha um papel crucial no processo de infecção pois permite a entrada do retrovírus na célula.

• As glicoproteínas são sintetizadas no retículo endoplasmático inicialmente como uma poliproteína precursora: a gp 61.
• Posteriormente, essa poliproteína é levada ao complexo de Golgi onde é glicosilada e clivada pela ação de uma protease celular, gerando duas subunidades.
• A primeira é a glicoproteína de superfície (gp 46) responsável pela ligação do retrovírus ao receptor da célula alvo, e a segunda é a glicoproteína transmembrana (gp 21) responsável pela fusão do envelope viral com a membrana da célula-alvo 13,

As glicoproteínas e seus fragmentos já foram expressados em bactérias 17, em leveduras 10, em células de insetos 1 14 e em células de mamíferos 2, Além de usarem diferentes sistemas de expressão, estes trabalhos também diferem quanto a utilização dos produtos recombinantes; as glicoproteínas do envelope do HTLV-1 podem ser incorporadas às reações bioquímicas in vitro, com o objetivo de estudar a formação de sincícios e a entrada do vírus nas células alvo 4, podem ser utilizadas no diagnóstico da infecção pelo HTLV-1 11 ou podem ser utilizadas em protocolos de imunização experimental de animais, com o objetivo de produzir uma vacina recombinante contra o vírus 9,

O objetivo do trabalho é a expressão in vitro da gp 21 do envelope do HTLV-1 em células de mamíferos. A obtenção de uma linhagem celular que expresse constitutivamente a proteína recombinante será de grande utilidade para a realização de ensaios de imunogenicidade e no diagnóstico da infecção pelo HTLV-1.

MATERIAL E MÉTODOS Isolamento, amplificação e preparação do fragmento referente a gp 21, O fragmento codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR, a partir do DNA proviral, com a utilização dos primers 5′-CCTGTTCCCACCCTAGGATCC-3′ e 5′-GAAGTTGCTGCAGGAGAAGGAG-3′ na primeira reação, e 5′-GAATTCCATGGGAGCCGGAGTGGCTGGC-3′ e 5′-GCGGCCGCTTACAGGGATGACTCAGGTTTTATAAG-3′ na seunda reação.

A seqüência de nucleotídeos utilizada para o desenho dos primers foi a do protótipo ATK-1, depositada no GenBank sob o número de acesso J02029, referente ao genoma completo do HTLV-1. O par de primers utilizado na segunda reação foi responsável pela adição das seqüências codificantes dos sítios de restrição das enzimas Eco RI na região terminal 5′ e Not I na região terminal 3′ do fragmento amplificado.

O produto da PCR foi submetido à extração com fenol clorofórmio, seguida de precipitação com acetato de sódio 2M. O DNA precipitado foi diluído com 40uL de água estéril. Clonagem e subclonagem do fragmento de interesse em vetores plasmidiais. O fragmento codificante da gp 21 foi clonado no vetor pCR2.1TOPO (Invitrogen, São Paulo, Brazil) conforme as instruções do fabricante.

Bactérias Escherichia coli da linhagem DH5a (Clontech, Heidelberg, Germany) competentes foram preparadas e transformadas com o vetor recombinante pelo método do cloreto de cálcio gelado por meio do choque térmico 12, de acordo com protocolos já descritos 8, A cultura foi submetida à minipreparação de plasmídeo, realizada com a utilização do kit QIAprep Spin Miniprep Kit (50) (Qiagem, Hilden, Germany), segundo as instruções do fabricante.

O fragmento codificante da gp 21 contido no vetor recombinante foi digerido usando as enzimas de restrição EcoR I e Not I na mesma reação, que foi processada a 37ºC durante 3 horas. O fragmento liberado foi purificado do gel de agarose com a utilização do QUIAEX II Gel extraction kit (Qiagem, Hilden, Germany), conforme as instruções do fabricante e, posteriormente, foi clonado no vetor de expressão em células de mamíferos pcDNA3.1+ (Invitrogen, São Paulo, Brazil).

1. O vetor de expressão foi primeiramente linearizado com as enzimas de restrição EcoR I e Not I.
2. Após a purificação por meio da extração com fenol-clorofórmio, a desfosforilação foi realizada com a utilização da enzima fostatase alcalina proveniente de camarão, Shrimp Alkaline Phosphatase ( SAP ) (USB Corporation, Cleaveland, USA).

A reação foi conduzida a 37ºC durante 1 hora. A enzima foi desativada por incubação a 65ºC, durante 15 minutos. A ligação do vetor com o fragmento previamente preparado foi realizada com a utilização de da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen, São Paulo, Brazil), conforme as instruções do fabricante.

• Bactérias Escherichia coli da linhagem DH5a competentes foram preparadas e transformadas com o vetor recombinante, conforme descrito neste mesmo item.
• Seqüenciamento do fragmento inserido no vetor recombinante.
• Para o seqüenciamento foi utilizado o ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Foster City, USA).

O protocolo da reação foi conduzido conforme as especificações do fabricante. Foram feitas duas reações: a primeira com o primer universal T7 sense e a segunda com o primer universal BGH anti- sense, Os produtos das reações foram submetidos à precipitação com acetato de potássio 3M e etanol absoluto.

• A eletroforese foi conduzida no aparelho ABI Prism 377 DNA Sequencer (Applied Biossytems, Foster City, USA), usando gel de poliacrilamida a 4%, com 6M de uréia, a 1.500V, temperatura de 51ºC, durante 6 horas.
• Os eletroferogramas obtidos foram analisados por meio do software ABI Analysis Data Collection e posteriormente convertidos em seqüências de nucleotídeos por meio do software DNA Sequencing Analysis Software Versão 3.3.

A montagem das seqüências consenso foi realizada pelo software Sequencher versão 4.05 (Gene Codes Corp, Ann Arbor, USA). Transfecção de células de mamíferos com o vetor recombinante. As células da linhagem HEK 293 7 foram utilizadas para a expressão da gp 21 e encontram-se depositadas no American Type Culture Collection (ATCC) sob o número de acesso CRL-1573.

• A transfecção transitória foi realizada por meio da técnica de lipofecção (tranfecção por lipossomos) 5 com a utilização do LipofectAMINE Reagent (Invitrogen, São Paulo, Brazil), conforme as instruções do fabricante.
• Passadas 48 horas, as culturas foram coletadas pela adição da solução de tripsina (0,25% (v/v) tripsina, 1mM EDTA.4Na) e lavadas duas vezes com tampão PBS.

A transfecção permanente foi realizada por meio da técnica de eletroporação 3, Às cubetas foram adicionados 2,0×10 7 células e 15ug de DNA. A eletroporação foi processada a 1,2 Kv, 200 ohms e 10uF. Após 10 dias de tratamento da cultura com 800ug/mL do antibiótico geneticina G418, observou-se o aparecimento de clones isolados que foram coletados para a expansão.

Culturas semiconfluentes foram coletadas e utilizadas para a análise. Análise da expressão do RNAm codificante da glicoproteína transmembrana. A extração do RNA total das células transfectadas foi feita com utilização do RNAsy Mini Kit (Qiagem, Hilden, Germany) de acordo com as instruções do fabricante.

O RNA extraído foi utilizado na PCR como template para controle da contaminação com DNA genômico. Os primers 5′-GAATTCCATGGGAGCCGGAGTGGCTGGC-3′ e 5′-GCGGCCGCTTACAGGGATGACTCAGGTTTTATAAG-3′ foram utilizados. A análise da expressão do RNAm foi realizada por RT-PCR.

O cDNA foi produzido com o primer anti- sense 5′-GCGGCCGCTTACAGGGATGACTCAGGTTTTATAAG-3′ por meio da utilização do kit Superscript II (Invitrogen, São Paulo, Brazil), conforme as instruções do fabricante. A PCR foi conduzida conforme já descrito neste item. Análise da expressão da glicoproteína transmembrana recombinante.

As células tranfectadas foram analisadas quanto a produção da gp 21 recombinante pela técnica de citometria de fluxo. Foram utilizadas 1×10 6 células de cada amostra para o experimento. O sedimento celular foi ressuspendido com uma solução fixadora e permeabilizadora (paraformaldeído 2% (m/v), EGTA 50mM, e Triton X-100 0,3% (v/v) em tampão PBS), que agiu a 37ºC durante 10 minutos.

• Após a lavagem com tampão PBS, as células foram submetidas à incubação com a solução de bloqueio (albumina de soro bovino 2% (m/v), soro de cabra 5% (v/v) em tampão PBS) a 37ºC durante 1 hora.
• A marcação com o anticorpo primário monoclonal anti gp 21 de HTLV-1, produzido em camundongo (NEN Life Science Products, Boston, USA) (diluído 1:100 em solução de bloqueio), foi realizada também a 37ºC durante 1 hora.

Posteriormente, as células foram lavadas com tampão PBS e o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado com FITC (GAM – Goat antimouse IgG FITC) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) foi adicionado, agindo por 15 minutos a temperatura ambiente sob o abrigo da luz.

Após duas etapas de lavagem com tampão PBS as células foram analisadas pelo software Cell Quest no aparelho FAC Sort (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA). Como controle positivo foram utilizadas células da linhagem MT-2, que possuem o genoma do HTLV-1 inserido em seu material genético. Para o controle negativo da produção da proteína recombinante foram utilizadas células HEK 293 não transfectadas.

RESULTADOS O fragmento gênico correspondente à região codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR, inserido no vetor de clonagem pCR2.1TOPO e subclonado no vetor de expressão pcDNA3.1+, com a utilização das enzimas de restrição Eco RI e Not I.

1. A presença do fragmento codificante da gp 21 no vetor de recombinante foi confirmada por meio do seqüenciamento de nucleotídeos.
2. A mostra o eletroferograma que representa parte da seqüência obtida quando utilizado o primer T7 sense, indicando a localização do códon iniciador da tradução.
3. O vetor recombinante, depois de confirmado, foi inserido em células de mamíferos da linhagem HEK 293.

A transfecção transitória foi realizada e após 48 horas de cultivo com meio de cultura apropriado, as células foram coletadas para as análises. Clones isolados foram observados na transfecção permanente após 10 dias de tratamento das células com o antibiótico.

Depois de isolados e expandidos, os clones foram novamente coletados para as análises. O RT-PCR foi realizado e um fragmento de 506pb foi amplificado (tamanho aproximado da gp 21 contendo as seqüências codificantes dos sítios de restrição para as enzimas Eco RI e Not I) indicando a presença do RNAm codificante da gp 21, como mostra a,

A expressão transitória do RNAm codificante da gp 21 não foi observada. As células tranfectadas foram analisadas também quanto a produção da proteína recombinante, por meio da técnica de citometria de fluxo. Primeiramente, foram analisadas células da linhagem MT-2 (que possuem o genoma do HTLV-1 inserido em seu material genético) para o controle positivo da produção da gp 21.

Células da linhagem HEK 293 não transfectadas foram utilizadas como controle negativo. Os resultados obtidos com as amostras da transfecção permanente e transitória, respectivamente, se encontram representados no gráfico da ; 64% das células da cultura mista e 48% das células do clone isolado apresentaram fluorescência, indicando a expressão da proteína recombinante.

DISCUSSÃO A glicoproteína transmembrana é considerada uma das proteínas mais imunogênicas do HTLV-1. A obtenção de uma linhagem celular que expresse a proteína recombinante constitutivamente possibilita o estudo mais aprofundado dos mecanismos que envolvem a gp 21 com a infectividade do vírus, por meio da utilização da linhagem celular transfectada em ensaios laboratoriais de imunogenicidade e de diagnóstico.

• O fragmento codificante da gp 21 foi clonado em vetores plasmidiais e confirmado pelo seqüenciamento de nucleotídeos.
• A expressão da gp 21 recombinante foi possibilitada pela utilização do vetor de expressão pcDNA3.1+ sob o controle do promotor de citomegalovírus.
• Duas técnicas foram utilizadas para a transfecção da linhagem celular de mamífero HEK 293: lipofecção e eletroporação.

A lipofecção foi a mais reprodutível, rápida e de baixo custo. A transfecção foi realizada de maneira transitória e permanente. Na expressão transitória não foi observada a presença do RNAm codificante da gp 21, provavelmente pela pouca quantidade de células utilizadas na extração do RNA total, e por se tratar de uma cultura mista onde parte das células não têm o vetor recombinante.

A proteína recombinante foi detectada em 64% das células analisadas. Na transfecção permanente três clones foram analisados quanto à produção do RNAm codificante da gp 21; todos são positivos. A proteína recombinante também está sendo expressada em 48% das células do clone analisado. Como a técnica utilizada para essa análise não é quantitativa, não é possível afirmar que a expressão foi maior nas células da transfecção transitória do que na transfecção permanente.

Também, porque o resultado se refere a amostragem utilizada e não ao total de células. Uma linhagem celular que expresse a proteína recombinante de maneira definitiva será estudada.

1. Por fim, pode-se concluir que tanto a cultura mista (expressão transitória) quanto o clone (expressão permanente) analisados demonstraram uma significativa porcentagem de células expressando a gp 21 do HTLV-1 recombinante.
2. Recebido para publicação em 5/2/2004
3. Aceito em 25/1/2006

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• Dra Flora Cristina Lobo Penteado Centro Regional de Hemoterapia do HCFMRP/Hemocentro de Ribeirão Preto R. Tenente Catão Roxo 2501 14051-140 Ribeirão Preto, SP, Brasil Tel: 55 16 2101-9300, Fax: 55 16 2101-9309

• Publicação nesta coleção 05 Maio 2006
• Data do Fascículo Abr 2006

• Aceito 25 Jan 2006
• Recebido 05 Fev 2004

: Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do retrovírus HTLV-1 em células de mamíferos

Qual a diferença entre proteína e glicoproteína?

As proteínas são classificadas segundo a forma e a função, agindo em sistemas e órgãos do corpo humano, sendo: Cromoproteínas → proteínas que conferem características pigmentares. Glicoproteínas → proteínas associadas a grupamentos glicídicos, comum no glicocalix.

Lipoproteínas → proteínas associadas a grupamentos lipídicos. Nucleoproteínas → proteínas com funções voltadas especificamente para as atividades que ocorrem no núcleo. Endocrinoproteínas → proteínas com atividade hormonal, por exemplo, a insulina, que participa na redução do nível de açúcar no sangue.

Não pare agora. Tem mais depois da publicidade 😉 Globina → proteína que compõe a molécula de hemoglobina. Albumina → proteína importante na nutrição do embrião. Fibrinogênio → proteína componente do plasma sanguíneo, participando do processo de coagulação.