Um novo método pode rastrear mudanças na expressão genética de células vivas durante longos períodos de tempo. Baseado na espectroscopia Raman, o método não agride as células e pode ser realizado repetidamente. Crédito: Notícias do MIT; iStock
Um novo COMO método desenvolvido combina espectroscopia Raman com aprendizado de máquina para rastrear de forma não invasiva a expressão genética nas células ao longo do tempo. Esta técnica permite o estudo detalhado da diferenciação celular e tem aplicações potenciais na pesquisa do câncer, biologia do desenvolvimento e diagnóstico.
Sequenciando todos os ARN em uma célula pode revelar uma grande quantidade de informações sobre a função dessa célula e o que ela está fazendo em um determinado momento. No entanto, o processo de sequenciamento destrói a célula, dificultando o estudo das mudanças contínuas na expressão genética.
Uma abordagem alternativa desenvolvida no MIT poderia permitir aos investigadores acompanhar essas mudanças durante longos períodos de tempo. O novo método, baseado em uma técnica de imagem não invasiva conhecida como espectroscopia Raman, não danifica as células e pode ser realizado repetidamente.
Usando esta técnica, os investigadores mostraram que podiam monitorizar células estaminais embrionárias à medida que se diferenciavam em vários outros tipos de células ao longo de vários dias. Esta técnica poderá permitir estudos de processos celulares de longo prazo, como a progressão do cancro ou o desenvolvimento embrionário, e um dia poderá ser utilizada para diagnóstico de cancro e outras doenças.
“Com a imagem Raman, é possível medir muito mais pontos no tempo, o que pode ser importante para estudar a biologia do câncer, a biologia do desenvolvimento e uma série de doenças degenerativas”, diz Peter So, professor de engenharia biológica e mecânica do MIT, diretor do MIT. Laser Biomedical Research Center e um dos autores do artigo.
Koseki Kobayashi-Kirschvink, pós-doutorado no MIT e no Broad Institute of Harvard e MIT, é o principal autor do estudo, que foi publicado recentemente na revista Biotecnologia da Natureza. Os autores seniores do artigo são Tommaso Biancalani, ex-cientista do Broad Institute; Jian Shu, professor assistente da Harvard Medical School e membro associado do Broad Institute; e Aviv Regev, vice-presidente executivo da Genentech Research and Early Development, que está afastado de cargos docentes no Broad Institute e no Departamento de Biologia do MIT.
Expressão genética de imagem
A espectroscopia Raman é uma técnica não invasiva que revela a composição química de tecidos ou células, incidindo sobre eles luz infravermelha próxima ou visível. O Centro de Pesquisa Biomédica a Laser do MIT tem trabalhado em espectroscopia Raman biomédica desde 1985 e, recentemente, So e outros no centro desenvolveram técnicas baseadas em espectroscopia Raman que poderiam ser usadas para diagnosticar câncer de mama ou medir glicemia.
No entanto, a espectroscopia Raman por si só não é sensível o suficiente para detectar sinais tão pequenos quanto alterações nos níveis de moléculas individuais de RNA. Para medir os níveis de RNA, os cientistas normalmente usam uma técnica chamada sequenciamento de RNA unicelular, que pode revelar os genes que estão ativos em diferentes tipos de células em uma amostra de tecido.
Neste projeto, a equipe do MIT procurou combinar as vantagens do sequenciamento de RNA unicelular e da espectroscopia Raman, treinando um modelo computacional para traduzir sinais Raman em estados de expressão de RNA.
“O sequenciamento de RNA fornece informações extremamente detalhadas, mas é destrutivo. Raman não é invasivo, mas não diz nada sobre o RNA. Portanto, a ideia deste projeto era usar o aprendizado de máquina para combinar a força de ambas as modalidades, permitindo assim compreender a dinâmica dos perfis de expressão gênica no nível de célula única ao longo do tempo”, diz Kobayashi-Kirschvink.
Para gerar dados para treinar seu modelo, os pesquisadores trataram células de fibroblastos de camundongos, um tipo de célula da pele, com fatores que reprogramam as células para se tornarem células-tronco pluripotentes. Durante este processo, as células também podem fazer a transição para vários outros tipos de células, incluindo células neurais e epiteliais.
Usando espectroscopia Raman, os pesquisadores criaram imagens das células em 36 pontos no tempo ao longo de 18 dias, à medida que se diferenciavam. Depois que cada imagem foi tirada, os pesquisadores analisaram cada célula usando hibridização in situ por fluorescência de molécula única (smFISH), que pode ser usada para visualizar moléculas específicas de RNA dentro de uma célula. Neste caso, procuraram moléculas de RNA que codificam nove genes diferentes cujos padrões de expressão variam entre os tipos de células.
Esses dados smFISH podem então atuar como um elo entre os dados de imagem Raman e os dados de sequenciamento de RNA unicelular. Para estabelecer essa ligação, os investigadores primeiro treinaram um modelo de aprendizagem profunda para prever a expressão desses nove genes com base nas imagens Raman obtidas dessas células.
Em seguida, eles usaram um programa computacional chamado Tangram, desenvolvido anteriormente no Broad Institute, para vincular os padrões de expressão do gene smFISH com perfis de genoma completos que haviam obtido através da realização de sequenciamento de RNA unicelular nas células da amostra.
Os pesquisadores então combinaram esses dois modelos computacionais em um que eles chamam de Raman2RNA, que pode prever perfis genômicos completos de células individuais com base em imagens Raman das células.
Rastreamento de diferenciação celular
Os pesquisadores testaram seu algoritmo Raman2RNA rastreando células-tronco embrionárias de camundongos à medida que elas se diferenciavam em diferentes tipos de células. Eles tiraram imagens Raman das células quatro vezes ao dia durante três dias e usaram seu modelo computacional para prever os perfis de expressão de RNA correspondentes de cada célula, que confirmaram comparando-os com medições de sequenciamento de RNA.
Usando esta abordagem, os investigadores foram capazes de observar as transições que ocorriam em células individuais à medida que se diferenciavam das células estaminais embrionárias em tipos de células mais maduras. Eles também mostraram que poderiam rastrear as mudanças genômicas que ocorrem quando os fibroblastos de camundongos são reprogramados em células-tronco pluripotentes induzidas, durante um período de duas semanas.
“É uma demonstração de que a imagem óptica fornece informações adicionais que permitem rastrear diretamente a linhagem das células e a evolução de sua transcrição”, diz So.
Os investigadores planeiam agora utilizar esta técnica para estudar outros tipos de populações de células que mudam ao longo do tempo, tais como células envelhecidas e células cancerígenas. Eles estão agora trabalhando com células cultivadas em laboratório, mas no futuro, eles esperam que esta abordagem possa ser desenvolvida como um potencial diagnóstico para uso em pacientes.
“Uma das maiores vantagens do Raman é que é um método sem rótulos. Ainda está muito longe, mas há potencial para a tradução humana, o que não poderia ser feito usando as técnicas invasivas existentes para medir perfis genômicos”, diz Jeon Woong Kang, cientista pesquisador do MIT que também é autor do estudo.
Referência: “Predição de perfis de expressão de RNA unicelular em células vivas por microscopia Raman com Raman2RNA” por Koseki J. Kobayashi-Kirschvink, Charles S. Comiter, Shreya Gaddam, Taylor Joren, Emanuelle I. Grody, Johain R. Ounadjela, Ke Zhang, Baoliang Ge, Jeon Woong Kang, Ramnik J. Xavier, Peter TC So, Tommaso Biancalani, Jian Shu e Aviv Regev, 10 de janeiro de 2024, Biotecnologia da Natureza.
DOI: 10.1038/s41587-023-02082-2
A pesquisa foi financiada pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência, Bolsa de Pós-Doutorado para Pesquisadores Estrangeiros, pela Naito Foundation Overseas Postdoctoral Fellowship, pela MathWorks Fellowship, pela Helen Hay Whitney Foundation, pelos EUA. Instituto Nacional de Saúdeo Instituto Nacional de Imagens Biomédicas e Bioengenharia dos EUA, o HubMap, o Howard Hughes Medical Institute e o Klarman Cell Observatory.
