A configuração experimental de Daan Boltje e Ernest van der Wee. A lente do microscópio óptico (canto inferior direito) está rodeada de ar e olha através de uma placa de vidro para a pequena esfera. No topo da placa de vidro, a amostra é colocada em uma gota d’água. A distância entre a placa de vidro e a esfera é ajustável, permitindo aos pesquisadores variar a profundidade. Crédito: Universidade de Tecnologia de Delft
Estudar tecidos, células e proteínas ao microscópio é essencial para a prevenção e tratamento de doenças. Esta pesquisa requer medir com precisão as dimensões dessas estruturas biológicas. No entanto, quando vistas através de um microscópio óptico, estas amostras podem por vezes parecer mais achatadas do que a sua verdadeira forma.
Investigadores da Universidade de Tecnologia de Delft demonstraram agora pela primeira vez que esta distorção não é constante, ao contrário do que muitos cientistas assumiram durante décadas. A descoberta, publicada em ÓPTICO, confirma uma previsão do ganhador do Nobel Stefan Hell dos anos 90. Com uma ferramenta e software de cálculo online, cada pesquisador pode agora determinar a profundidade correta de uma amostra biológica.
Amostra achatada
Ao visualizar amostras biológicas com um microscópio, o feixe de luz é perturbado se a lente da objetiva estiver em um meio diferente do da amostra. Por exemplo, ao observar uma amostra aquosa com uma lente rodeada de ar, os raios de luz curvam-se mais acentuadamente no ar ao redor da lente do que na água. Esta perturbação faz com que a profundidade medida na amostra seja menor que a profundidade real.
Como resultado, a amostra parece achatada. “Esse problema é conhecido há muito tempo e, desde a década de 80, foram desenvolvidas teorias para determinar um fator corretivo para determinação da profundidade. No entanto, todas estas teorias assumiram que este factor era constante, independentemente da profundidade da amostra. Isto aconteceu apesar do facto de o posterior prémio Nobel Stefan Hell ter apontado na década de 90 que esta escala poderia ser dependente da profundidade”, explica o professor associado Jacob Hoogenboom.
Cálculos, experimentos e ferramenta web
Sergey Loginov, ex-pós-doutorando na Universidade de Tecnologia de Delft, mostrou com cálculos e um modelo matemático que a amostra realmente parece mais achatada perto da lente do que mais longe. O candidato ao doutorado Daan Boltje e o pós-doutorado Ernest van der Wee confirmaram posteriormente no laboratório que o fator corretivo depende da profundidade.
Van der Wee: “Compilamos nossos resultados em uma ferramenta web e software fornecido com o artigo. Com essas ferramentas, qualquer pessoa pode determinar o fator corretivo preciso para seu experimento.”
Compreendendo anormalidades e doenças
“Em parte graças à nossa ferramenta de cálculo, agora podemos cortar com muita precisão uma proteína e seus arredores de um sistema biológico para determinar a estrutura com microscopia eletrônica. Este tipo de microscopia é muito complexo, demorado e incrivelmente caro. Garantir que você está olhando para a estrutura certa é, portanto, muito importante”, afirma Boltje.
“Com a nossa determinação de profundidade mais precisa, precisamos gastar muito menos tempo e dinheiro em amostras que não atingiram o alvo biológico. Em última análise, podemos estudar proteínas e estruturas biológicas mais relevantes. E determinar a estrutura precisa de uma proteína num sistema biológico é crucial para a compreensão e, em última análise, o combate a anomalias e doenças.”
Sobre a ferramenta web
Na ferramenta web, você pode preencher os detalhes relevantes do seu experimento, como os índices de refração, o ângulo de abertura da objetiva e o comprimento de onda da luz usada. A ferramenta então exibe a curva para o fator de escala dependente da profundidade. Você também pode exportar esses dados para seu próprio uso. Além disso, você pode representar graficamente o resultado em combinação com o resultado de cada uma das teorias existentes.
Referência: “Escalonamento dependente da profundidade de distâncias axiais em microscopia de luz” por EB van der Wee, SV Loginov, MNF Hensgens, DB Boltje e JP Hoogenboom, 19 de abril de 2024, ÓPTICO.
DOI: doi:10.1364/OPTICA.520595
